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微生物的實驗室培養_(2014上課)_圖文

到目前為止, 幾十項Nobel生理學和醫學獎,化學獎 都與微生物學有關

病毒:

無細胞結構

原核生物: 細菌、藍藻 原核細胞 微生物的類群 原生生物:單細胞的動植物
如草履蟲、單細胞藻類等 真核細胞

真菌: 如酵母菌

課題1

微生物的實驗室培養 1.提供營養和條件 2.防止污染

一.培養基:微生物生存的環境和營養物質

思考:微生物“吃”什么? 1.基本成分:碳源、氮源、水、無機鹽
⑴碳源 無機碳源:CO2、CO32-、HCO3- 自養微生物 有機碳源:牛肉膏、蛋白胨等 異養微生物

⑵氮源

無機氮源:NH4+、NO3-(為硝化細菌提供N源和能源) 有機氮源:牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等

注:含CHON的有機物是異養型微生物的碳源、氮源、能源

一.培養基:微生物生存的環境和營養物質
1.基本成分:碳源、氮源、水、無機鹽 2.特殊營養:維生素、堿基等(生長因子)
(牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有)

3.pH、氧氣的需求:

4.種類:物理性質:

固體培養基

有無

液體培養基

凝固劑瓊脂

分離 化學成分:天然培養基 工業

鑒定

合成培養基 生產

牛肉膏蛋白胨培養基 是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養基。
1000ml牛肉膏蛋白胨培養基的配方 瓊脂20.0g 牛肉膏 5g
蛋白胨 10g Nacl 5g H2O 定容至1000ml
分析營養構成?

請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或 滅菌。如果需要,請選擇合適的方法。
(1) 培養細菌用的培養基與培養皿 (2) 玻棒、試管、燒瓶和吸管 (3) 實驗操作者的雙手

二.無菌技術:防止外來雜菌的污染
1.消毒與滅菌:
2.無菌范圍:實驗操作空間消毒 操作者的手、衣著消毒 實驗用具滅菌 實驗操作過程
酒精燈旁操作

超凈工作臺

有些細菌在一定的條件下,細胞里面 形成一個橢圓形的休眠體,叫做芽孢。 芽孢的壁很厚,對干旱、低溫、高溫 等惡劣的環境有很強的抵抗力。例如, 有的細菌的芽孢,煮沸3小時以后才死 亡。芽孢又小又輕,可以隨風飄散。 當環境適宜(如溫度、水分適宜)的 時候,芽孢又可以萌發,形成一個細 菌
細菌、原生動物、真菌和植 物等產生的一種有繁殖作用 的生殖細胞。能直接發育成 新個體。

菌落
1.定義: 單個 固體培養基上 或少數菌體 大量繁殖
2.特征: 大小、形狀、光澤度、 顏色、透明度等。
3.功能: 鑒定菌種的重要依據

子細胞群體

三.大腸桿菌的純化培養:分散成單個細胞,形成單個菌落
㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養基
1.計算:培養基用量 依配方計算各成分的用量
2.稱量:牛10肉00膏ml黏牛稠肉,膏用蛋稱白量胨紙培稱養取基的配方 牛肉膏、蛋白瓊胨脂易2吸0.0潮g ,要快、加蓋
3.溶化:牛肉膏、稱量牛紙肉膏、少5量g 水加熱溶解 →取紙 →蛋白胨、蛋N白aC胨l→瓊10脂g →補水定容
4.調pH、分裝、封口:Nacl 5g 5.滅菌:培養基、H培2O養皿定容至1000ml 6.倒平板:

約50℃

倒平板
灼燒滅菌, 防止瓶口的微生物污染培養基

防止皿蓋上的水珠落入培養基,造成污染

1.培養基滅菌后,需要冷卻到50 ℃左右時, 才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養基的 溫度?
答:可以用手觸摸盛有培養基的錐形 瓶,感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手 時,就可以進行倒平板了。
2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰?
答:通過灼燒滅菌,防止瓶口的微 生物污染培養基。

3.平板冷凝后,為什么要將平板倒置?
答:平板冷凝后,皿蓋上會凝結水珠,凝固 后的培養基表面的濕度也比較高,將平板倒置, 既可以使培養基表面的水分更好地揮發,又可以 防止皿蓋上的水珠落入培養基,造成污染。
4.在倒平板的過程中,如果不小心將培養基濺 在皿蓋與皿底之間的部位,這個平板還能用來 培養微生物嗎?為什么?
答:空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之 間的培養基上滋生,因此最好不要用這個平板 培養微生物。

二.大腸桿菌的純化培養: ㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養基 ㈡純化大腸桿菌:
1.純化大腸桿菌的方法:平板劃線法和稀釋涂布平板法 ⑴平板劃線法: 接種環

菌種 防止劃破培養基

(重復實驗) 劃3個平板 1個不劃線
(空白對照)

平板劃線法
平板劃線法是通過接種環在瓊脂固體培養基表 面連續劃線的操作,將聚集的菌種逐步稀釋分散到 培養基的表面。在數次劃線后培養,可以分離到由 一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體。

1、為什么在操作的第一步以及每次劃線之前 都要灼燒接種環?在劃線操作結束時,仍然需 要灼燒接種環嗎?為什么?
操作的第一步灼燒接種環是為了避免接種環上 可能存在的微生物污染培養物
殺死上次殘留的菌種,保證使下一次劃線時, 菌種直接來源于上次劃線的末端,從而通過劃 線次數的增加,使每次劃線時菌種的數目逐漸 減少,以便得到菌落。
及時殺死接種環上殘留的菌種,避免細菌污染 環境和感染操作者。

2.在灼燒接種環之后,為什么要等其 冷卻后再進行劃線?
答:以免接種環溫度太高,殺死菌種。
3.在作第二次以及其后的劃線操作時, 為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線?
答:劃線后,線條末端細菌的數目比線 條起始處要少,每次從上一次劃線的末端開 始,能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而 逐步減少,最終能得到由單個細菌繁殖而來 的菌落。

⑵稀釋涂布平板法: a.梯度稀釋菌液:

微量 移 液器

1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

101

102

103

104

105

106

菌液

6支試管,分別加入9ml無菌水

稀浸



⑵稀釋涂布平板法: 釋



a.梯度稀釋菌液: 103

104

b.涂布平板:









稀 釋

105



不超過0.1ml

各梯度分別涂布3個平板



1個不涂布作空白對照

稀釋涂布法
稀釋涂布法是將菌液進行一系列梯度稀釋, 然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培 養基的表面,進行培養。

涂布平板的所有操作都應在火焰附近 進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌 操作要求,想一想,第2步應如何進行無 菌操作?
應從操作的各個細節保證“無菌”。 例如:酒精燈與培養皿的距離要合適、
吸管頭不要接觸任何其他物體、 吸管要在酒精燈火焰周圍等等。

3.平板劃線法和稀釋涂布平板法的比較

優點 可以觀察菌落特 平板劃線 征,對混合菌進 分離法 行分離
稀釋涂布 可以計數,可以 平板法 觀察菌落特征

缺點
不能計數
吸收量較少、 較麻煩,平板 不干燥效果不 好,容易蔓延

適用范圍 適用于好氧菌
適用于厭氧菌 和兼性厭氧菌





二.大腸桿菌的純化培養釋:



㈠制備牛肉膏蛋白胨固10體3 培養基

104





㈡純化大腸桿菌:

1.接種:



⑴平板劃線法:



105

⑵稀釋涂布平板法:



2.培養: 將接種后的培養基和一個未接種的培養基

放入37℃恒溫箱中培養12h~24h后,

觀察并記錄

(三)菌種的保藏:
1.臨時保藏:試管固體斜面培養基上, 培養長成菌落 4℃冰箱保存 菌種易被污染、變異
2.長期保存: 甘油管藏 1ml甘油(滅菌)+1ml菌液
-20℃

擱置斜 面

四、課題成果評價
(一)培養基的制作是否合格 如果未接種的培養基在恒溫箱中保溫1~2 d后無 菌落生長,說明培養基的制備是成功的,否則需要重新 制備。 (二)接種操作是否符合無菌要求 如果培養基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基 本一致,并符合大腸桿菌菌落的特點,則說明接種操作 是符合要求的;如果培養基上出現了其他菌落,則說明 接種過程中,無菌操作還未達到要求,需要分析原因, 再次練習。 (三)是否進行了及時細致的觀察與記錄 培養12 h與24 h后的大腸桿菌菌落的大小會有明 顯不同,及時觀察記錄的同學會發現這一點,并能觀察 到其他一些細微的變化。這一步的要求主要是培養學生 良好的科學態度與習慣。

課堂小結

定義:人們按照微生物對營養物質的

培養基

不同需求,配置出供其生長繁 殖的營養物質

微 生

基礎 知識

分類:固體培養基 液體培養基 定義:培養微生物的操作中,所有防

物 的

無菌技術

止雜菌污染的方法

消毒與滅菌

培 養

實驗操作

常用滅菌方法 制備牛肉膏蛋白胨固體培養基
純化大腸桿菌

結果分析與評價




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